脊椎動物的性別決定系統(tǒng)主要分為基因型性別決定（GSD）和環(huán)境性別決定（ESD）。環(huán)境性別決定中最突出的形式是溫度依賴性性別決定（TSD），在這種情況下，胚胎發(fā)育關(guān)鍵階段（即溫度敏感期，TSP）的孵化溫度決定了后代的性別。近期，有客戶使用多個云克隆ELISA試劑盒（CEA911Ge/CEA540Ge/CEA462Ge/CEA458Ge/CEA443Ge/CEA461Ge）在《Science Bulletin》上發(fā)表的相關(guān)研究闡明了紅耳龜雄性決定途徑的調(diào)控模式。研究表明紅耳龜?shù)臏孛纛惞檀忌杉?xì)胞（TSSCs）中Ca²⁺誘導(dǎo)的醛固酮分泌在TSP期間對雄性性別決定起著關(guān)鍵作用；位于前支持細(xì)胞中的NR3C1（雄性決定途徑的主要調(diào)節(jié)因子）作為醛固酮受體，對于上調(diào)DMRT1（雄性性別決定基因）表達和協(xié)調(diào)雄性性別決定至關(guān)重要。

圖1. 龜類溫度依賴性雄性性別決定轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式圖

（圖片源自《Science Bulletin》）

研究者首先從紅耳龜在雌性產(chǎn)生溫度（FPT，32℃）和雄性產(chǎn)生溫度（MPT，26℃）下孵化的個體中分離出胚胎性腺，并將性腺分化期定義為不同的階段（第16~20階段）。隨后在不同階段采集發(fā)育中的性腺，通過單細(xì)胞測序研究其分子和細(xì)胞過程。作者發(fā)現(xiàn)，到胚胎起始階段（第15階段），龜?shù)纳诚僖呀?jīng)包含了單細(xì)胞測序鑒定出的所有細(xì)胞類型。這表明溫度依賴性性別決定機制在生殖腺系統(tǒng)高度分化狀態(tài)下起作用，這依賴于先前存在的細(xì)胞群的進一步特化和重排。

作者發(fā)現(xiàn)在單細(xì)胞分辨率下，TSSCs主要表達的蛋白種類和其他類型細(xì)胞不同，主要是KCNK3、Ca_V3.2和Ca_V1.2。從第15階段到第19階段TSSCs數(shù)量的下降和TSP的持續(xù)時間一致，表明TSSCs在溫度敏感期起關(guān)鍵作用。此外，基因富集分析（KEGG）和基因本體論（GO）分析結(jié)果表明類固醇生成活性是TSSCs的關(guān)鍵功能。

圖2. 胚胎性腺單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析

（圖片源自《Science Bulletin》）

為了探究細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號是否調(diào)節(jié)TSSCs中的醛固酮生成，作者在細(xì)胞水平上對KCNK3和Ca_V通道進行了藥理學(xué)干預(yù)。結(jié)果顯示，將培養(yǎng)溫度從32℃降至26℃特異性地增加了TSSCs中的醛固酮合成，且醛固酮在性腺中呈分泌高峰，而其他類固醇激素則無此現(xiàn)象。阻斷KCNK3導(dǎo)致TSSCs產(chǎn)生鈣離子內(nèi)流，且使用選擇性醛固酮合成酶抑制劑BI-689648能夠有效降低醛固酮水平。表明性腺支持細(xì)胞數(shù)量的減少可能是導(dǎo)致醛固酮生成存在溫度敏感窗口的原因。

圖3. TSSCs和性腺中的類固醇生成 

（圖片源自《Science Bulletin》）

接著，作者就醛固酮的生成發(fā)生和雄性性別決定溫度之間的關(guān)系進行了研究。鑒于在28℃時兩性均可發(fā)育，作者研究了醛固酮注射是否能促進雄性分化。結(jié)果表明，醛固酮的應(yīng)用顯著提高了雄性個體的產(chǎn)量，使性別比例從平衡狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌詾橹鳌Ｔ?6℃的全雄性溫度下，用BI-689648使雌性比例顯著上升。而在32℃醛固酮的應(yīng)用不能誘導(dǎo)雌性向雄性轉(zhuǎn)變。這些結(jié)果支持了由溫度-鈣離子信號系統(tǒng)調(diào)節(jié)的TSSCs衍生的醛固酮是雄性性別決定途徑中的主要決定因素。

圖4. 醛固酮產(chǎn)生增強雄性性別決定

（圖片源自《Science Bulletin》）

隨后，作者探究了醛固酮在調(diào)節(jié)支持細(xì)胞特化中的作用。通過細(xì)胞譜系軌跡分析發(fā)現(xiàn)醛固酮對海龜NR3C1的核轉(zhuǎn)位、DNA結(jié)合以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控至關(guān)重要。在龜類中NR3C1對醛固酮結(jié)合以及雄性發(fā)育途徑中具有重要作用。利用醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯可使NR3C1對DMRT1基因的調(diào)節(jié)作用降低約70%。此外，NR3C1還能增強ATF1和DMRT1對DMRT1基因的轉(zhuǎn)錄激活作用。表明NR3C1、ATF1和DMRT1在DMRT1基因表達中存在協(xié)同效應(yīng)。

為了闡明體內(nèi)NR3C1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，作者使用螺內(nèi)酯來探究在全雄性發(fā)育溫度下通過抑制NR3C1對雄性發(fā)育的影響。26℃下螺內(nèi)酯處理的141個胚胎中，87個生殖腺呈類雌性形態(tài)（皮質(zhì)增厚、髓索退化），其生殖細(xì)胞標(biāo)記物（VASA）和支持細(xì)胞標(biāo)記物（SOX9）陽性細(xì)胞的分布也與雌性類似。這些發(fā)現(xiàn)表明破壞NR3C1會在全雄性溫度下誘導(dǎo)雌性發(fā)育，凸顯醛固酮結(jié)合的NR3C1對雄性發(fā)育途徑調(diào)節(jié)的關(guān)鍵作用。

圖5. 醛固酮結(jié)合NR3C1觸發(fā)DMRT1表達以確定雄性性別分化

（圖片源自《Science Bulletin》）

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了溫度啟動TSD物種雄性性別決定的全新雄性特異性途徑。為理解龜類雄性決定的分子細(xì)胞基礎(chǔ)及探索不同進化背景下的TSD模式奠定了基礎(chǔ)。

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