文獻導讀

2021年5月8日，來自美國羅格斯大學羅伯特伍德約翰遜醫(yī)學院的Leonard Y Lee和Shaohua Li教授在《Autophagy》上聯(lián)合發(fā)表了題為“CREG1 promotes lysosomal biogenesis and function”的文章。

研究介紹

E1A激活基因抑制子（CREG）最初被認為是一種轉錄抑制因子，后來發(fā)現(xiàn)CREG是一種可以分泌到細胞培養(yǎng)基中的糖蛋白，分為CREG1和CREG2。CREG1對胚胎發(fā)育和正常生理至關重要，其失調與各種疾病有關，包括神經退行性變、糖尿病和癌癥。然而，人們對CREG1在自噬中的作用知之甚少。因此，作者對其功能進行了探討。

CREG1蛋白在脾臟、肝臟、肺、白色脂肪組織以及白細胞和骨髓中均高表達。超量表達實驗表明，CREG1主要靶向于核內質溶酶體室。通過對LO2肝細胞中的內源性CREG1進行了免疫染色，作者確定CREG1是一種核內質溶酶體蛋白。進一步地，作者發(fā)現(xiàn)N端糖基化是CREG1從內質網運輸?shù)絻荣|網-溶酶體室所必需的。為了確定小鼠胚胎發(fā)育過程中CREG1的定位，作者用CREG1抗體與核內質和溶酶體隔間的標記物共免疫染色E7.5小鼠胚胎。CREG1定位于囊泡的頂端，在內臟內胚層細胞中呈點狀高表達。小鼠胚胎在內臟卵黃囊發(fā)育的后期，內體室發(fā)育良好，由管狀和囊狀結構組成。在E16.5內臟卵黃囊內，CREG1在內胚層細胞頂端的泡狀結構中高水平表達。內臟內胚層主要參與營養(yǎng)吸收和降解，為胎兒提供氨基酸和其他營養(yǎng)物質。為了完成這些功能，內臟內胚層細胞在頂端形成大量突出的空泡(包含溶酶體蛋白)，并通過大胞吞作用和其他形式的內吞作用，積極內化母體免疫球蛋白。因此，作者對內臟卵黃囊共進行了CREG1和IgG的免疫染色，并觀察到IgG與CREG1在內胚層細胞頂端共定位，CREG1也與溶酶體膜蛋白LAMP2共定位于內臟內胚層的基底側。這表明，CREG1可能在胞吞作用以及內體分選和轉運中發(fā)揮重要作用。

為了確定CREG1是否參與肝細胞的大胞吞作用和其他形式的內吞作用，作者將人CREG1和控制載體分別和人干細胞LO2轉染并在示蹤劑TRITIC-dextran中孵化。結果表明，超量表達CREG1顯著增加了LO2細胞對這些示蹤劑的攝取。之后，脈沖追逐（pulse-chase）實驗和功能喪失分析（loss-of-function analysis）的結果表明CREG1可以促進大胞吞作用，格行蛋白依賴性內吞作用和內吞運輸。

超量表達CREG1增加了內吞運輸以及CREG1與溶酶體標記的共定位。這表明，CREG1可能促進溶酶體生成。免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，人干細胞中超量表達CREG1增加了LAMP1、ATP6V1H、CTSC、preproCTSD和CTSD的表達。溶酶體蛋白的上調可能發(fā)生在轉錄后，因為它們的mRNA轉錄本沒有增加。在AML12小鼠肝細胞中，敲除CREG1降低了LAMP1、ATP6V1H、CTSD和HEXA的表達，相比之下，這些蛋白質的mRNA轉錄本要么沒有變化，要么略有增加。為了進一步證實CREG1在體內對溶酶體生物發(fā)生的調控，作者使用CRISPR技術通過在1-3外顯子側插入loxP位點得到CREG1 floxed小鼠。進一步與UBC-Cre/ERT2小鼠（在8周齡時腹腔注射他莫昔酚刪除Creg1基因）雜交得到Creg1^fl/fl小鼠，將creg1敲除小鼠與野生型C57BL/6小鼠雜交，得到了Creg1 ^+/-小鼠。檢測creg1^-/-小鼠肝臟溶酶體蛋白的表達發(fā)現(xiàn)敲除CREG1降低了ATP6V1H、CTSC、CTSD和HEXA的表達。這些結果說明CREG1在溶酶體生物發(fā)生中起著重要作用。

核內體的酸化對于內化配體-受體復合物的解離和受體的再循環(huán)是必不可少的。作者發(fā)現(xiàn)CREG1可以促進了內吞-溶酶體室的酸化。溶酶體的主要功能是通過內吞/吞噬作用消化細胞外吞噬的物質，以及通過自噬消化細胞不需要的成分。為了確定CREG1誘導的溶酶體生物發(fā)生和酸化是否對溶酶體功能有影響，作者通過免疫染色對SQSTM1/p62 (sequestosome 1)進行了氨基酸剝奪誘導自噬分析。LO2細胞的細胞質中檢測到高水平的SQSTM1呈點狀分布，而超量表達CREG1導致SQSTM1聚集物的顯著減少。氯喹抑制了溶酶體活性，阻斷了SQSTM1的減少。這表明，CREG1超量表達誘導的SQSTM1減少是由于溶酶體降解加速所致。綜上所述，超量表達CREG1主要通過增強溶酶體介導的降解來促進自噬。功能獲得和丟失分析顯示，CREG1促進溶酶體生物發(fā)生、酸化和降解，從而加速自噬通量。這些作用可能是由增強的內吞運輸介導的。

細胞自噬

細胞自噬（autophagy）是一個吞噬自身細胞質蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物的過程，藉此實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新。自噬在機體的生理和病理過程中都能見到，其所起的作用是正面還是負面的尚未完全闡明，例如：細胞在饑餓過程中會啟動自噬，但是也與許多病理過程相關比，如發(fā)育、分化、神經退行性疾病、應激、感染以及癌癥。mTOR 激酶是誘導自噬的重要調節(jié)分子，通過mTOR激活Akt 和 MAPK 信號轉導可以抑制自噬，而激活AMPK 和 p53 信號轉導則會促進自噬。在哺乳動物細胞中ULK1、ULK2、UKL3最為mTOR的下游，會激活自噬發(fā)生的重要復合體PI3K 形成，促進LC3-I 和LC3-II形成，調控自噬的發(fā)生。綜合目前的研究發(fā)現(xiàn)，LC3-II、Beclin-1和P62均可作為自噬發(fā)生檢測的標志物。

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